GDS-80低压基因枪投递大鼠GADD153载体验证凋亡机制


时间:2021-06-22
来源:互联网

  摘要:《Cardiovascular Research》刊发的文章中,研究人员使用低压加速基因枪GDS-80,按照制造商的方案将质粒转染到VSMC中。将2mg质粒DNA悬浮于5ml PBS中,并在15psi的氦气压力下输送至培养的血管平滑肌细胞。该方法的转染效率为30%。结果表明GADD153在牵张诱导的VSMC凋亡中起作用。

  GADD153(生长停滞和DNA损伤诱导基因153)是一种凋亡调节基因,在内质网(ER)应激期间表达增加。机械拉伸如何影响血管平滑肌细胞凋亡过程中GADD153的调节尚不完全清楚。

  在《Cardiovascular Research》中的一篇报道中,研究人员通过使用低压手持式基因枪向血管平滑肌细胞中投递大鼠GADD153启动子构建体,验证了机械牵张诱导凋亡的血管平滑肌细胞中GADD153表达的假说。

  研究人员将生长在柔性膜上的大鼠血管平滑肌细胞以60周/分钟的速度真空拉伸至最大延伸率的20%。采用成年大鼠主动脉-腔静脉分流模型研究GADD153的表达。拉伸18小时后,周期性拉伸显著增加GADD153蛋白和mRNA的表达。拉伸前30min加入c-jun N末端激酶(JNK)抑制剂SP600125、JNK siRNA、肿瘤坏死因子-a(TNF-a)和TNF-α受体抗体可抑制GADD153蛋白的诱导。

  一个-845到+85 bp的大鼠GADD153启动子构建体如下。用正向引物ctcgaggaaggca-taagagccatca和反向引物ccgcttctcctcagggttccggctgt扩增大鼠基因组DNA。扩增产物经M1uI和Bg1II限制性内切酶酶切后连接到用相同酶切的pGL3碱性荧光素酶质粒载体中。GADD153启动子包含AP-1保守位点(TGACTCA),位于–246到–240 bp。对于突变体,使用突变试剂盒突变AP-1结合位点。DNA测序证实了位点特异性突变。使用低压加速基因枪GDS-80,按照制造商的方案将质粒转染到VSMC中。将2mg质粒DNA悬浮于5ml PBS中,并在15psi的氦气压力下输送至培养的血管平滑肌细胞。该方法的转染效率为30%。

  凝胶位移实验表明,牵张后激活因子1(AP-1)的DNA结合活性增强。SP600125、JNK-siRNA和TNF-a抗体可消除牵张诱导的结合活性。拉伸增加,而GADD153 Mut质粒、SP600125和c-jun抗体消除了启动子活性。牵张血管平滑肌细胞的条件培养液和外源性给予非牵张血管平滑肌细胞TNF-α重组蛋白均可增加GADD153蛋白的表达,与牵张后相似。成年大鼠主动脉-腔静脉分流术的体内模型也显示主动脉中GADD153蛋白表达增加。

  周期性牵张增强培养大鼠血管平滑肌细胞GADD153的表达。牵张诱导的GADD153由TNF-α介导,至少部分通过JNK和AP-1途径介导。这些结果表明GADD153在牵张诱导的VSMC凋亡中起作用。

  [1] The molecular regulation of GADD153 in apoptosis of cultured vascular smooth muscle cells by cyclic mechanical stretch[J]. Cardiovascular Research, 2008(3):551-9.


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